berita

Dalam dekad yang lalu, teknologi penjujukan gen telah digunakan secara meluas dalam penyelidikan kanser dan amalan klinikal, menjadi alat penting untuk mendedahkan ciri-ciri molekul kanser. Kemajuan dalam diagnosis molekul dan terapi sasaran telah menggalakkan pembangunan konsep terapi ketepatan tumor dan membawa perubahan besar kepada keseluruhan bidang diagnosis dan rawatan tumor. Ujian genetik boleh digunakan untuk memberi amaran kepada risiko kanser, membimbing keputusan rawatan dan menilai prognosis, dan merupakan alat penting untuk meningkatkan hasil klinikal pesakit. Di sini, kami meringkaskan artikel terbaru yang diterbitkan dalam CA Cancer J Clin, JCO, Ann Oncol dan jurnal lain untuk menyemak aplikasi ujian genetik dalam diagnosis dan rawatan kanser.

Mutasi somatik dan mutasi germline. Secara amnya, kanser berpunca daripada mutasi DNA yang boleh diwarisi daripada ibu bapa (mutasi germline) atau diperoleh dengan usia (mutasi somatik). Mutasi garis kuman wujud sejak lahir, dan mutasi biasanya membawa mutasi dalam DNA setiap sel dalam badan dan boleh diturunkan kepada keturunan. Mutasi somatik diperolehi oleh individu dalam sel bukan gametik dan biasanya tidak diturunkan kepada keturunan. Kedua-dua mutasi germline dan somatik boleh memusnahkan aktiviti fungsi normal sel dan membawa kepada transformasi sel malignan. Mutasi somatik adalah pemacu utama keganasan dan biomarker paling ramalan dalam onkologi; walau bagaimanapun, kira-kira 10 hingga 20 peratus pesakit tumor membawa mutasi germline yang meningkatkan risiko kanser mereka dengan ketara, dan beberapa mutasi ini juga bersifat terapeutik.
Mutasi pemandu dan mutasi penumpang. Tidak semua varian DNA menjejaskan fungsi sel; secara purata, ia mengambil masa lima hingga sepuluh kejadian genomik, yang dikenali sebagai "mutasi pemacu," untuk mencetuskan degenerasi sel normal. Mutasi pemacu sering berlaku dalam gen yang berkait rapat dengan aktiviti kehidupan sel, seperti gen yang terlibat dalam peraturan pertumbuhan sel, pembaikan DNA, kawalan kitaran sel dan proses hidup lain, dan berpotensi untuk digunakan sebagai sasaran terapeutik. Walau bagaimanapun, jumlah mutasi dalam mana-mana kanser adalah agak besar, antara beberapa ribu dalam sesetengah kanser payudara hingga lebih daripada 100,000 dalam beberapa kanser kolorektal dan endometrium yang sangat berubah-ubah. Kebanyakan mutasi tidak mempunyai atau mengehadkan kepentingan biologi, walaupun mutasi berlaku di kawasan pengekodan, peristiwa mutasi yang tidak ketara itu dipanggil "mutasi penumpang". Jika varian gen dalam jenis tumor tertentu meramalkan tindak balas atau rintangannya terhadap rawatan, varian itu dianggap boleh dikendalikan secara klinikal.
Onkogen dan gen penekan tumor. Gen yang sering bermutasi dalam kanser boleh dibahagikan secara kasar kepada dua kategori, onkogen dan gen penekan tumor. Dalam sel normal, protein yang dikodkan oleh onkogen terutamanya memainkan peranan menggalakkan percambahan sel dan menghalang apoptosis sel, manakala protein yang dikodkan oleh gen oncosuppressor bertanggungjawab terutamanya untuk mengawal selia pembahagian sel secara negatif untuk mengekalkan fungsi sel normal. Dalam proses transformasi malignan, mutasi genomik membawa kepada peningkatan aktiviti onkogen dan penurunan atau kehilangan aktiviti gen oncosuppressor.
Variasi kecil dan variasi struktur. Ini adalah dua jenis mutasi utama dalam genom. Varian kecil mengubah DNA dengan menukar, memadam atau menambah sebilangan kecil asas, termasuk sisipan asas, pemadaman, anjakan bingkai, mula kehilangan kodon, menghentikan mutasi kehilangan kodon, dsb. Variasi struktur ialah penyusunan semula genom yang besar, yang melibatkan segmen gen yang bersaiz daripada beberapa ribu asas kepada sebahagian besar kromosom, termasuk perubahan penyalinan kromosom, penyalinan atau penduaan gen. Mutasi ini boleh menyebabkan pengurangan atau peningkatan fungsi protein. Selain perubahan pada tahap gen individu, tandatangan genomik juga merupakan sebahagian daripada laporan penjujukan klinikal. Tandatangan genomik boleh dilihat sebagai corak kompleks variasi kecil dan/atau struktur, termasuk beban mutasi tumor (TMB), ketidakstabilan mikrosatelit (MSI) dan kecacatan penggabungan semula homolog.

Mutasi klon dan mutasi subklonal. Mutasi klon terdapat dalam semua sel tumor, hadir semasa diagnosis, dan kekal hadir selepas kemajuan rawatan. Oleh itu, mutasi klon mempunyai potensi untuk digunakan sebagai sasaran terapeutik tumor. Mutasi subklonal hanya terdapat dalam subset sel kanser dan boleh dikesan pada permulaan diagnosis, tetapi hilang dengan pengulangan berikutnya atau muncul hanya selepas rawatan. Heterogenitas kanser merujuk kepada kehadiran pelbagai mutasi subklonal dalam satu kanser. Terutamanya, sebahagian besar mutasi pemacu yang ketara secara klinikal dalam semua spesies kanser biasa adalah mutasi klon dan kekal stabil sepanjang perkembangan kanser. Rintangan, yang sering dimediasi oleh subklon, mungkin tidak dikesan pada masa diagnosis tetapi muncul apabila ia berulang selepas rawatan.

Teknik tradisional FISH atau karyotype sel digunakan untuk mengesan perubahan pada tahap kromosom. FISH boleh digunakan untuk mengesan gabungan gen, pemadaman dan amplifikasi, dan dianggap sebagai "standard emas" untuk mengesan varian sedemikian, dengan ketepatan dan kepekaan yang tinggi tetapi daya pemprosesan terhad. Dalam sesetengah keganasan hematologi, terutamanya leukemia akut, karyotyping masih digunakan untuk membimbing diagnosis dan prognosis, tetapi teknik ini secara beransur-ansur digantikan oleh ujian molekul yang disasarkan seperti FISH, WGS, dan NGS.
Perubahan dalam gen individu boleh dikesan oleh PCR, kedua-dua PCR masa nyata dan PCR drop digital. Teknik ini mempunyai kepekaan yang tinggi, amat sesuai untuk pengesanan dan pemantauan lesi sisa kecil, dan boleh memperoleh keputusan dalam masa yang agak singkat, kelemahannya ialah julat pengesanan adalah terhad (biasanya hanya mengesan mutasi dalam satu atau beberapa gen), dan keupayaan untuk melakukan pelbagai ujian adalah terhad.
Imunohistokimia (IHC) ialah alat pemantauan berasaskan protein yang biasa digunakan untuk mengesan ekspresi biomarker seperti ERBB2 (HER2) dan reseptor estrogen. IHC juga boleh digunakan untuk mengesan protein bermutasi tertentu (seperti BRAF V600E) dan gabungan gen tertentu (seperti gabungan ALK). Kelebihan IHC ialah ia boleh disepadukan dengan mudah ke dalam proses analisis tisu rutin, jadi ia boleh digabungkan dengan ujian lain. Di samping itu, IHC boleh memberikan maklumat mengenai penyetempatan protein subselular. Kelemahannya ialah skalabiliti terhad dan permintaan organisasi yang tinggi.
Penjujukan generasi kedua (NGS) NGS menggunakan teknik penjujukan selari melalui tinggi untuk mengesan variasi pada peringkat DNA dan/atau RNA. Teknik ini boleh digunakan untuk menyusun kedua-dua keseluruhan genom (WGS) dan kawasan gen yang diminati. WGS menyediakan maklumat mutasi genomik yang paling komprehensif, tetapi terdapat banyak halangan untuk aplikasi klinikalnya, termasuk keperluan untuk sampel tisu tumor segar (WGS belum lagi sesuai untuk menganalisis sampel tidak bergerak formalin) dan kos yang tinggi.
Penjujukan NGS yang disasarkan termasuk penjujukan keseluruhan exon dan panel gen sasaran. Ujian ini memperkayakan kawasan yang menarik dengan probe DNA atau amplifikasi PCR, dengan itu mengehadkan jumlah penjujukan yang diperlukan (keseluruhan exome membentuk 1 hingga 2 peratus daripada genom, malah panel besar yang mengandungi 500 gen membentuk hanya 0.1 peratus daripada genom). Walaupun penjujukan ekson keseluruhan berfungsi dengan baik dalam tisu tetap formalin, kosnya kekal tinggi. Kombinasi gen sasaran adalah agak menjimatkan dan membolehkan fleksibiliti dalam memilih gen untuk diuji. Selain itu, beredar DNA bebas (cfDNA) muncul sebagai pilihan baharu untuk analisis genomik pesakit kanser, yang dikenali sebagai biopsi cecair. Kedua-dua sel kanser dan sel normal boleh melepaskan DNA ke dalam aliran darah, dan DNA yang ditumpahkan daripada sel kanser dipanggil DNA tumor beredar (ctDNA), yang boleh dianalisis untuk mengesan potensi mutasi dalam sel tumor.
Pilihan ujian bergantung kepada masalah klinikal khusus yang perlu ditangani. Kebanyakan biomarker yang dikaitkan dengan terapi yang diluluskan boleh dikesan oleh teknik FISH, IHC, dan PCR. Kaedah ini adalah munasabah untuk pengesanan sejumlah kecil biomarker, tetapi ia tidak meningkatkan kecekapan pengesanan dengan peningkatan daya pengeluaran, dan jika terlalu banyak biomarker dikesan, mungkin tidak terdapat tisu yang mencukupi untuk pengesanan. Dalam sesetengah kanser tertentu, seperti kanser paru-paru, di mana sampel tisu sukar diperoleh dan terdapat berbilang biomarker untuk diuji, menggunakan NGS adalah pilihan yang lebih baik. Kesimpulannya, pilihan ujian bergantung kepada bilangan biomarker yang akan diuji untuk setiap pesakit dan bilangan pesakit yang akan diuji untuk biomarker. Dalam sesetengah kes, penggunaan IHC/FISH adalah mencukupi, terutamanya apabila sasaran telah dikenal pasti, seperti pengesanan reseptor estrogen, reseptor progesteron dan ERBB2 dalam pesakit kanser payudara. Jika penerokaan mutasi genomik yang lebih komprehensif dan pencarian sasaran terapeutik yang berpotensi diperlukan, NGS lebih teratur dan kos efektif. Selain itu, NGS boleh dipertimbangkan dalam kes di mana keputusan IHC/FISH adalah samar-samar atau tidak konklusif.

Garis panduan yang berbeza memberi panduan tentang pesakit yang sepatutnya layak untuk ujian genetik. Pada tahun 2020, Kumpulan Kerja Perubatan Ketepatan ESMO mengeluarkan pengesyoran ujian NGS yang pertama untuk pesakit kanser lanjutan, mengesyorkan ujian NGS rutin untuk kanser paru-paru bukan sel kecil bukan skuamosa lanjutan, kanser prostat, kanser kolorektal, kanser saluran hempedu dan sampel tumor kanser ovari, dan pada tahun 2024, ESMO mengemas kini berdasarkan kemasukan kanser payudara dan tumor yang jarang berlaku, mengesyorkan kemasukan kanser payudara dan tumor yang jarang berlaku. Seperti tumor stroma gastrousus, sarkoma, kanser tiroid dan kanser yang tidak diketahui asalnya.
Pada tahun 2022, Pendapat Klinikal ASCO mengenai ujian genom somatik pada pesakit dengan kanser metastatik atau lanjutan menyatakan bahawa jika terapi berkaitan biomarker diluluskan pada pesakit dengan tumor pepejal metastatik atau lanjutan, ujian genetik disyorkan untuk pesakit ini. Sebagai contoh, ujian genomik harus dilakukan pada pesakit dengan melanoma metastatik untuk menyaring mutasi BRAF V600E, kerana perencat RAF dan MEK diluluskan untuk petunjuk ini. Selain itu, ujian genetik juga perlu dilakukan sekiranya terdapat penanda rintangan yang jelas untuk ubat yang akan diberikan kepada pesakit. Egfrmab, sebagai contoh, tidak berkesan dalam kanser kolorektal mutan KRAS. Apabila mempertimbangkan kesesuaian pesakit untuk penjujukan gen, status fizikal pesakit, komorbiditi dan peringkat tumor harus disepadukan, kerana siri langkah yang diperlukan untuk penjujukan genom, termasuk persetujuan pesakit, pemprosesan makmal dan analisis hasil penjujukan, memerlukan pesakit mempunyai kapasiti fizikal dan jangka hayat yang mencukupi.
Sebagai tambahan kepada mutasi somatik, sesetengah kanser juga perlu diuji untuk gen germline. Ujian untuk mutasi garis kuman boleh mempengaruhi keputusan rawatan untuk kanser seperti mutasi BRCA1 dan BRCA2 dalam kanser payudara, ovari, prostat dan pankreas. Mutasi germline mungkin juga mempunyai implikasi untuk pemeriksaan dan pencegahan kanser pada masa hadapan pada pesakit. Pesakit yang berpotensi sesuai untuk ujian mutasi germanium perlu memenuhi syarat tertentu, yang melibatkan faktor seperti sejarah keluarga kanser, umur semasa diagnosis dan jenis kanser. Walau bagaimanapun, ramai pesakit (sehingga 50%) yang membawa mutasi patogen dalam talian kuman tidak memenuhi kriteria tradisional untuk ujian mutasi garis kuman berdasarkan sejarah keluarga. Oleh itu, untuk memaksimumkan pengenalpastian pembawa mutasi, Rangkaian Kanser Komprehensif Kebangsaan (NCCN) mengesyorkan agar semua atau kebanyakan pesakit dengan kanser payudara, ovari, endometrium, pankreas, kolorektal atau prostat diuji untuk mutasi garis kuman.
Berkenaan dengan masa ujian genetik, kerana sebahagian besar mutasi pemacu yang ketara secara klinikal adalah klon dan agak stabil sepanjang perkembangan kanser, adalah munasabah untuk melakukan ujian genetik ke atas pesakit pada masa diagnosis kanser lanjutan. Untuk ujian genetik seterusnya, terutamanya selepas terapi sasaran molekul, ujian ctDNA adalah lebih berfaedah daripada DNA tisu tumor, kerana DNA darah boleh mengandungi DNA daripada semua lesi tumor, yang lebih kondusif untuk mendapatkan maklumat tentang heterogeniti tumor.
Analisis ctDNA selepas rawatan mungkin dapat meramalkan tindak balas tumor terhadap rawatan dan mengenal pasti perkembangan penyakit lebih awal daripada kaedah pengimejan standard. Walau bagaimanapun, protokol untuk menggunakan data ini untuk membimbing keputusan rawatan belum ditetapkan, dan analisis ctDNA tidak disyorkan melainkan dalam ujian klinikal. ctDNA juga boleh digunakan untuk menilai lesi sisa kecil selepas pembedahan tumor radikal. Ujian ctDNA selepas pembedahan adalah peramal kuat perkembangan penyakit seterusnya dan boleh membantu menentukan sama ada pesakit akan mendapat manfaat daripada kemoterapi adjuvant, tetapi masih tidak disyorkan untuk menggunakan ctDNA di luar ujian klinikal untuk membimbing keputusan kemoterapi adjuvant.

Pemprosesan data Langkah pertama dalam penjujukan genom ialah mengekstrak DNA daripada sampel pesakit, menyediakan perpustakaan, dan menjana data penjujukan mentah. Data mentah memerlukan pemprosesan lanjut, termasuk menapis data berkualiti rendah, membandingkannya dengan genom rujukan, mengenal pasti pelbagai jenis mutasi melalui algoritma analisis yang berbeza, menentukan kesan mutasi ini pada terjemahan protein, dan menapis mutasi garis kuman.
Anotasi gen pemandu direka untuk membezakan mutasi pemandu dan penumpang. Mutasi pemandu membawa kepada kehilangan atau peningkatan aktiviti gen penindas tumor. Varian kecil yang membawa kepada penyahaktifan gen penindas tumor termasuk mutasi karut, mutasi anjakan bingkai dan mutasi tapak penyambungan utama, serta pemadaman kodon mula yang kurang kerap, pemadaman kodon hentikan dan pelbagai mutasi pemasukan/pemadaman intron. Di samping itu, mutasi missense dan mutasi sisipan/pemadaman intron kecil juga boleh menyebabkan kehilangan aktiviti gen penindas tumor apabila menjejaskan domain fungsian yang penting. Varian struktur yang membawa kepada kehilangan aktiviti gen penindas tumor termasuk pemadaman gen separa atau lengkap dan varian genomik lain yang membawa kepada kemusnahan bingkai bacaan gen. Varian kecil yang membawa kepada fungsi onkogen yang dipertingkatkan termasuk mutasi missense dan sesekali sisipan/penghapusan intron yang menyasarkan domain fungsi protein yang penting. Dalam kes yang jarang berlaku, pemotongan protein atau mutasi tapak splicing boleh menyebabkan pengaktifan onkogen. Variasi struktur yang membawa kepada pengaktifan onkogen termasuk gabungan gen, pemadaman gen dan pertindihan gen.
Tafsiran klinikal variasi genomik menilai kepentingan klinikal mutasi yang dikenal pasti, iaitu potensi diagnostik, prognostik atau nilai terapeutiknya. Terdapat beberapa sistem penggredan berasaskan bukti yang boleh digunakan untuk membimbing tafsiran klinikal variasi genomik.
Pangkalan Data Onkologi Perubatan Ketepatan Memorial Sloan-Kettering (OncoKB) mengelaskan varian gen kepada empat tahap berdasarkan nilai ramalannya untuk penggunaan dadah: Tahap 1/2, biomarker yang diluluskan oleh FDA atau standard klinikal yang meramalkan tindak balas petunjuk khusus kepada ubat yang diluluskan; Tahap 3, biomarker yang diluluskan atau tidak diluluskan FDA yang meramalkan tindak balas terhadap ubat sasaran novel yang telah menunjukkan janji dalam ujian klinikal, dan Tahap 4, biomarker bukan FDA yang meramalkan tindak balas terhadap ubat sasaran novel yang telah menunjukkan bukti biologi yang meyakinkan dalam ujian klinikal. Subkumpulan kelima yang dikaitkan dengan rintangan rawatan telah ditambah.
Garis panduan American Society for Molecular Pathology (AMP)/American Society of Clinical Oncology (ASCO)/College of American Pathologists (CAP) untuk tafsiran variasi somatik membahagikan variasi somatik kepada empat kategori: Gred I, dengan kepentingan klinikal yang kukuh; Gred II, dengan potensi kepentingan klinikal; Gred III, kepentingan klinikal tidak diketahui; Gred IV, tidak diketahui signifikan secara klinikal. Hanya varian gred I dan II yang berharga untuk keputusan rawatan.
Skala Kebolehoperasian Klinikal Sasaran Molekul (ESCAT) ESMO mengelaskan varian gen kepada enam tahap: Tahap I, sasaran yang sesuai untuk kegunaan rutin; Fasa II, sasaran yang masih dikaji, mungkin akan digunakan untuk menyaring populasi pesakit yang boleh mendapat manfaat daripada ubat sasaran, tetapi lebih banyak data diperlukan untuk menyokongnya. Gred III, varian gen yang disasarkan yang telah menunjukkan manfaat klinikal dalam spesies kanser lain; Gred IV, hanya varian gen yang disasarkan yang disokong oleh bukti praklinikal; Dalam gred V, terdapat bukti untuk menyokong kepentingan klinikal penyasaran mutasi, tetapi terapi ubat tunggal terhadap sasaran tidak memanjangkan kelangsungan hidup, atau strategi rawatan gabungan boleh diguna pakai; Gred X, kekurangan nilai klinikal.